¿Por qué necesitamos centrifugar una muestra?
- Para agilizar el proceso de sedimentación, separando el plasma sanguíneo y el suero de los componentes celulares de la sangre.
- Ciertos procesos analíticos requieren que la muestra sea separada del paquete globular de manera prioritaria (plasma o suero)
¿Con qué centrifugamos?
Con una centrífuga, la cual es un equipo que pone en rotación una muestra para separar por fuerza centrífuga sus componentes o fases (generalmente una sólida y una líquida), en función de su densidad.
Existen diversos tipos de centrífugas:
- Centrifugas de baja velocidad de mesa
- Pequeño tamaño
- Sin refrigeración
- Máxima velocidad 5000 rpm
- Útil para partículas grandes
- Microcentrífugas
- Velocidades altas mayores de 10000 rpm y tubos cortos
- Volúmenes muy pequeños
- Útiles en biología molecular
- Centrifugas de alta velocidad
- Velocidades a partir de 50000rpm
- Presentan sistemas auxiliares como refrigeración y alto vacío
- Ultracentrífugas
- Centrifuga para separación de proteínas: entre 20000 y 75000 rpm
¿Cuál es el principio?
La centrifugación es un método por el cual se pueden separar sólidos de líquidos de diferente densidad por medio de una fuerza giratoria.
La fuerza centrífuga es provista por una máquina llamada centrífuga, la cual imprime a la mezcla un movimiento de rotación que origina una fuerza que produce la sedimentación de los sólidos o de las partículas de mayor densidad.
¿Qué tipos de centrifugación existe?
- Centrifugación diferencial. Aprovecha la diferencia de velocidad de sedimentación de las distintas moléculas de una mezcla. Así, las partículas de densidades similares sedimentan juntas. Usualmente se usa para separar componentes de una mezcla y constituye el paso preparatorio para procesos de separación de moléculas.
- Centrifugación isopícnica. Añade medios de distinta densidad a partículas que comparten el mismo coeficiente de sedimentación, para poder separarlas mediante la fuerza centrífuga.
- Centrifugación zonal. Separa las partículas de una mezcla a partir de su diferencia de velocidad de sedimentación y también su masa, dado que la mezcla se coloca previamente encima de un gradiente de densidad preformado, haciendo las veces de “colador” de partículas gracias a la fuerza centrífuga.
- Ultracentrifugación. Monitorea las estructuras empleando luz ultravioleta o interferómetros, a medida que se sedimentan, mediante sistemas de rotor (fijo o de columpio). Es muy útil para estudiar las estructuras subcelulares
¿Qué variables pueden afectar la centrifugación?
- Fuerzas.
- Masa y densidad de las partículas: Cuan más densas se separarán más fácilmente.
- Densidad del medio: Alta concentración de azúcares aumenta la densidad haciendo más difícil la separación.
- Aceleración de la gravedad, directamente proporcional a la velocidad.
- Tiempo: Destrucción elementos.
¿Cómo debo preparar las muestras?
- Partir de una correcta toma de muestra.
- Homogeneización de la muestra de sangre con el aditivo a través de mezcla por inversión.
- Tiempo de espera adecuado para permitir la retracción del coágulo en tubos con activador de coágulo o sin aditivo para la obtención de suero antes de centrifugar.
- Conocer el tiempo y rpm adecuadas para centrifugar cada tipo de tubo de acuerdo con las indicaciones del fabricante.
- Los tubos deben ser de una calidad adecuada para soportar la fuerza centrífuga a la que serán sometidos.
- Tener en cuenta caducidad de tubos.
¿Qué hay que tener en cuenta?
- Centrifugar las muestras luego de la retracción del coágulo.
- Temperatura óptima: 15 – 24oC
- No se recomienda re-centrifugar tubos con gel separador.
- La separación de suero de las células debe tener lugar dentro de las 2 horas posteriores a la recolección de la muestra para evitar resultados erróneos de las pruebas.
- Recomendaciones de centrifugación.
¿Cuál son los puntos más críticos?
- Conocer el tipo de centrífuga tenemos en el laboratorio de acuerdo con el tipo de rotor si es de ángulo fijo o rotor oscilante.
- Ajustar adecuadamente la velocidad y tiempo de centrifugación, ya que protocolos incorrectos pueden causar roturas de los tubos.
- Balanceo: La carga desequilibrada por peso desequilibra el rotor cuando esta gira a gran velocidad, ocasionando daños en la centrífuga y posible rotura de los tubos de muestra.
¿Qué problemas puedo tener si no preparo bien mi muestra antes de centrifugar?
- Separación inadecuada de la muestra con mala formación de coágulo.
- Obtención de barrera de Gel no consistente.
¿Qué problemas puedo tener si centrifugo más de la cuenta?
Hemolisis.
¡Ahora a ponerlo en práctica!
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